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[建议] 上海沪峰生物人(Human)囊虫病抗体(CYT-Ab)ELISA 检测试剂...

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发表于 2010-12-24 19:12 | 显示全部楼层 |阅读模式
人(Human)囊虫病抗体(CYT-Ab)ELISA 检测试剂盒
# M; H) h7 K2 U本试剂仅供研究使用 标本:血清或血浆
* Q2 I9 d6 W4 s4 h7 i. |; t试验原理:+ \; X$ Y- U! E3 R
CYT-Ab试剂盒是间接法酶联免疫吸附实验(ELISA).已知CYT-Ab浓度的标准品、未知浓度的样品加入微
  l" V' x& |8 n( X孔酶标板内进行检测.先将CYT-Ab和生物素标记的抗体同时温育.洗涤后,加入亲和素标记过的HRP.再
  w1 W' d, B& q9 G" r$ {经过温育和洗涤,去除未结合的酶结合物,然后加入底物A、B,和酶结合物同时作用.产生颜色.颜色
$ s' W: Q5 y2 ~2 k5 D的深浅和样品中CYT-Ab的浓度呈比例关系.0 N" l4 x5 C& Y
试剂盒内容及其配制# z& `5 h2 A: W* [6 b
试剂盒成份(2-8℃保存) 96孔配置 48孔配置 配制4 b2 _( }5 h" o! p. f1 Q
96/48人份酶标板 1块板(96T) 半块板(48T) 即用型. H) {2 J% G  a! I
塑料膜板盖 1块 半块 即用型
, w2 C( x. i" T3 X; i标准品:40IU/L 1瓶(0.6ml) 1瓶(0.3ml) 按说明书进行稀稀/ v3 z) ^/ x) k& c& M2 i2 P
空白对照 1瓶(1.0ml) 1瓶(0.5ml) 即用型" f4 f* Y# p2 [* ^0 g1 `, I- B' S, T
标准品稀释缓冲液 1瓶(5ml) 1瓶(2.5ml) 即用型
3 _& Q. k$ `5 |- M生物素标记的抗CYT-Ab抗体 1瓶(6ml) 1瓶(3.0ml) 即用型
9 o3 _9 n/ [+ O6 i# a2 B! Q亲和链酶素-HRP 1瓶(10ml) 1瓶(5.0ml) 即用型
% k6 h) h# I6 ?- o% C- a洗涤缓冲液 1瓶(20ml) 1瓶(10ml) 按说明书进行稀释5 v* W4 t+ |  Y3 r
底物A 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型/ b, c2 u. v$ N! x" X
底物B 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型
: U" q) {9 g' a) `7 I# r终止液 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型# h% x, O5 J2 j3 z* s% H8 S- [
标本稀释液 1瓶(12ml) 1瓶(6.0ml) 即用型$ N! R4 j: Z# U0 L2 A
自备材料
; B5 Y0 z, Y( U$ t1. 蒸馏水.( R4 z" B4 i7 w3 v3 Q8 J5 o# V
2. 加样器:5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul.
& D- h/ X; }: M4 ~7 o. E3. 振荡器及磁力搅拌器等.
. H+ w: ^/ I8 u' l2 q+ t安全性/ d. X) z1 F5 B/ ?! M- o
1. 避免直接接触终止液和底物A、B.一旦接触到这些液体,请尽快用水冲洗.
+ B1 a* f6 w, F4 Z: A2. 实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品.
% S% |/ f$ |7 t6 X, u3. 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份.3 R7 D& t9 K- P+ H5 X; `
操作注意事项
4 U2 C" Q4 C1 w( m) {3 i1. 试剂应按标签说明书储存,使用前恢复到室温.稀稀过后的标准品应丢弃,不可保存.
+ K- t9 v- J' \% n2. 实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质.
6 `7 v8 ~1 V2 l+ C$ ]( n3. 不用的其它试剂应包装好或盖好.不同批号的试剂不要混用.保质前使用.# r. q9 e% G3 o2 y' S1 \
4. 使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物A、B液时,避免使用带金属部分的加样器
- d6 |7 ?2 H, k# f6 G.+ S7 k# G4 U7 M$ e7 A6 m2 _2 m
5. 使用干净的塑料容器配置洗涤液.使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品.8 d7 |. E# ]* H/ N
6. 洗涤酶标板时应充分拍干,不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水.4 z* [  g& E) ], A' w6 ^" h' {
7. 底物A应挥发,避免长时间打开盖子.底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下.避免用手接触$ _* N% h  m7 g7 E
,有毒.实验完成后应立即读取OD值.
; o+ s4 E: v! |  Q- `% x! w2 ]8. 加入试剂的顺序应一致,以保证所有反应板孔温育的时间一样.
+ x% |$ y2 ]: Y& w6 @0 k/ U9. 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作.
7 ^6 W. s! [  q1 j1 U0 f) e样品收集、处理及保存方法$ Y' v. P( ~+ l. N% Z# g
1、 血清-----操作过程中避免任何细胞刺激.使用不含热原和内毒素的试管.收集血液后,1000t1 w  N3 o/ U& B. P- Z- C& D: o
g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离.0 w; T; `/ m" l( b0 ]
2、 血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测.1000tg离心30分钟去除颗粒.: B+ V' t5 a6 \+ u$ {
3、 细胞上清液---1000tg离心10分钟去除颗粒和聚合物./ [9 S5 P: u' g2 C
4、 组织匀浆-----将组织加入适量生理盐水捣碎.1000tg离心10分钟,取上清液
8 e: D! p4 `$ p& G9 ?5、 保存------如果样品不立即使用,应将其分成小部分-70 ℃保存,避免反复冷冻.尽可能的不
' O& H- v0 x/ }( J5 n要使用溶血或高血脂血.如果血清中大量颗粒,检测前先离心或过滤.不要在37℃或更高的温度加热解3 o7 t" H, I$ ]0 r  S
冻.应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻.
8 F9 G- k8 n2 O" Z" m7 X: F试剂的准备
  ^, \3 D' W" P, f1. 标准品:标准品的系列稀释应在实验时准备,不能储存.稀释前将标准品振荡混匀.稀释比例* F7 j5 G  s* }2 \
按下表中进行:
- e+ G0 ~- Y* H, T* d+ x+ f40 IU/L (6号标准品) 原倍浓度不用稀释直接加入50ul.2 k  d' g+ w  G8 ]1 ]& ~' ~5 h# w
20 IU/L (5号标准品) 100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液7 |" p0 F( W' Q
10 IU/L (4号标准品) 100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液8 a5 s! W" C% s4 V# L, J
5.0 IU/L (3号标准品) 100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液
% O8 c: D  I+ e! X% ]9 O2.5 IU/L (2号标准品) 100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液- c3 N) }9 a5 l- Q
1.25 IU/L (1号标准品) 100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液
! Y! G% V0 u2 a9 w0 IU/L (空白对照) 原始浓度不用稀释直接加入50ul.* G4 N0 H7 T% o7 ^, Q$ _; d6 H8 ^
2. 洗涤缓冲液(50t)的稀释:蒸馏水50倍稀释.
+ s' |9 Y  r' X& T操作步骤
: V2 N; B) L: p9 Y7 z% k! P0 E# E1. 使用前,将所有试剂充分混匀.不要使液体产生大量的泡沫,以免加样时加入大量的气泡,产
6 @' S' o2 |. f+ q生加样上的误差.
; J! r! v& i. N' ?; _) p4 x1 V2. 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数.每个标准品和空白孔建议做复孔.每$ h$ {( D& g6 y( d4 t2 h
个样品根据自己的数量来定,能使用复孔的尽量做复孔.标本用标本稀释液1:1稀释后加入50ul于反应
, f! U, d3 J2 _# g) m3 \孔内.6 [+ D' b* U  B6 t' h" ^
3. 加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内.立即加入50ul的生物素2 J4 }! N* M1 L! c: s
标记的抗体.盖上膜板,轻轻振荡混匀,37℃温育1小时.# h! ?3 h7 O- L, S, T# W/ R
4. 甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干.重复此操作3次.如
' b. Z7 w1 d, k$ j: a果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次.
2 E) h0 f3 \6 x$ a  T5. 每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP,轻轻振荡混匀,37℃温育30分钟.4 |2 v7 j4 Y1 t6 J. ]' u
6. 甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干.重复此操作3次.如& I; H( t" ~+ D; Z
果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次.. \& l" C; R0 K9 B, U1 [4 f
7. 每孔加入底物A、B各50ul,轻轻振荡混匀,37℃温育10分钟.避免光照.
  F+ F$ ~2 e/ ]& {) ^* g3 M8. 取出酶标板,迅速加入50ul终止液,加入终止液后应立即测定结果.' P; t+ w. A) O( i/ w
9. 在450nm波长处测定各孔的OD值.! i2 A; P  h1 I: }
建议使用的实验方案; ^1 s2 m7 k( j% ~, Q7 J
标准品浓度(IU/L)
4 ]6 [' L$ k6 w. [& EA 40 40 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品样品4 k3 m$ [4 {2 h3 M7 J9 r% A
B 20 20 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品样品
# l- a) ]/ S8 S! j$ W) MC 10 10 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品样品
# D6 @3 E! `& a) _0 I& k+ G2 o% ~D 5.0 5.0 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品样品8 m1 Y; K: {6 G+ Y$ V6 D# _" c7 j7 m0 N
E 2.5 2.5 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品样品
! O: S: N, L# T, y+ F% L9 mF 1.25 1.25 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品样品
5 k* g+ q: ^( l8 h4 j1 o1 Z1 aG 0 0 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品样品
  m  |2 G* D# p8 s" w2 JH 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品样品
9 U! A3 }; i  `% i, H0 ]) y9 D局限
- ^$ a+ f0 m( n% N, C9 N6号标准品以上的结果为非线性的,根据此标准曲线无法得到精确的结果.% o. q+ [, ~$ ~4 ^
试剂盒性能
+ A/ F+ f' f* w4 u1. 灵敏度:最小的检测浓度小于1号标准品.稀释度的线性.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为
+ r# s7 l, g+ M* V- M0.990.
* r+ Q$ Q" l; E, d2 ~6 W9 Y2. 特异性:不与其它细胞因子反应.: Y% e0 X; I+ z# y
3. 重复性:板内、板间变异系数均小于10%.
) h/ r3 i- |1 s& h* ^9 j结果判断与分析1、仪器值:于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值2、以吸光度OD值为纵坐标(Y),相应的CYT-Ab标准品浓度为横坐标(X),做得相应的曲线,样品的8 w5 B9 C( e. U
CYT-Ab含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度.
3 }/ j: {2 K3 @% }+ i4 V3、检测值范围:0-40IU/L  z( X+ n# V( v  y$ I
4、敏感度: 0.1 IU/L
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